Розроблення заквашувального препарату із використанням мікроорганізмів роду ENTEROCOCCUS, виділених із традиційної карпатської бринзи

Abstract

Кушнір І. І. Розроблення заквашувального препарату із використанням мікроорганізмів роду Enterococcus , виділених із традиційної карпатської бринзи. Кваліфік ац ій н а наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття освітньо наукового ступеня док тора філософії за спеціальністю 204 Технології виробництва і п ереробки продукції тваринництва (20 Аграрні науки та продовольс тво) Львівський національний уні ве р с и тет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґ жицького, Львів, 2023, Інститут сільського господарства Карпатського регіону НААН України, Оброшине, 2023 Дисертаційна робота присвячена розробленню заквашувального препарату, виготовленого на о с н о ві молочнокислих бактерій (МКБ), виділених з природних еконіш і призначеного для виготовлення бринзи. На початковому етапі розроблення заквашувального препарату вивчали пробіотичні та технологічні властивості E. durans, SB6, E. faecium SB12, E. dur an s S B 1 8 та E. durans SB20 , виділених традиційної карпатської Встановлено, що досліджувані штами ентерококів проявляли різну антагоністичну активність до умовно патогенної мікрофлори, зокрема, E. coli S. enteritidis , E. aerogenes , P. mirabilis , P. аe r u g inosa, проте до грам позитивних мікроорганізмів ( S. аureus) антагоністичної дії не встановили. Із збільшенням температури культивування ентерококів (20, 30 і 37°С) зростала їх антагоністична активність. Зокрема, найоптимальнішою температурою культивув ан н я була 37 о С. За таких умов штам E.durans SB18 проявив найбільш виражену антагоністичну активність до усіх досліджуваних грам негативних мікроорганізмів, у тому числі P. аeruginosa. 3 Досліджувані штами виявилися чутливими до широкого спектру Досліджувані штами виявилися чутливими до широкого спектру антимікробниантимікробних х ппрреепаратів, за винятком гентаміцину, стрептоміцину, канаміцину паратів, за винятком гентаміцину, стрептоміцину, канаміцину та пеніцилінів. Важливо, що усі штами ентерококів були чутливими до та пеніцилінів. Важливо, що усі штами ентерококів були чутливими до ванкоміцину. За умови сумісного культивування ентерококів з умовнованкоміцину. За умови сумісного культивування ентерококів з умовно--патогенними мікроорганізмами виявили різний вплив на підпатогенними мікроорганізмами виявили різний вплив на підвивищщеенння їх ня їх чутливості до антибіотиків. Наприклад, штами чутливості до антибіотиків. Наприклад, штами E. faeciumE. faecium SB12 та SB12 та E. duransE. durans SB18 підвищували чутливість SB18 підвищували чутливість S. аureus S. аureus до гентаміцину, відповідно, на до гентаміцину, відповідно, на 16,2 та 16,2 та 14,8%, а сумісне культивування 14,8%, а сумісне культивування S. аureus S. аureus з ентерококами не впливало на зміну з ентерококами не впливало на зміну чутливості до амочутливості до амоксксииццииліну. ліну. При цьому вираженіший вплив на зміну чутливості При цьому вираженіший вплив на зміну чутливості проявив штампроявив штам E. durans SB18. E. durans SB18. ШтамШтам E. duransE. durans SB18 сприяв підищенню SB18 сприяв підищенню чутливості чутливості S. аureus S. аureus до ванкоміцину.до ванкоміцину. Виділені з традиційної карпатської бринзи штами ентерококів у різних Виділені з традиційної карпатської бринзи штами ентерококів у різних кількостях синтезували бікількостях синтезували біололооггіічно активні речовин. чно активні речовин. Встановлено, що штамВстановлено, що штам E. durans E. durans SB18 синтезує найбільшу кількість амінокислот, зокрема, незамінні SB18 синтезує найбільшу кількість амінокислот, зокрема, незамінні амінокислоти амінокислоти –– лізин, лізин, третіонін та лейцин+ізолейцин, третіонін та лейцин+ізолейцин, концентрація яких була концентрація яких була вищою, відповідно,вищою, відповідно, нана 10,3,10,3, 39,5 (р39,5 (р<<0,05) та 5,80,05) та 5,8 %, а так%, а такожож ззаамінні амінокислоти мінні амінокислоти серин та гліцин, концентрація яких була, відповідно, на 30,0 та 16,2серин та гліцин, концентрація яких була, відповідно, на 30,0 та 16,2 % (р% (р<<0,01) 0,01) вищою порівняно до контролю. вищою порівняно до контролю. Ентерококи синтезували вітаміни групи В, зЕнтерококи синтезували вітаміни групи В, з--посеред яких найбільше Впосеред яких найбільше В11, концентрація якого збільшувалась від 8,5 до 10 , концентрація якого збільшувалась від 8,5 до 10 разів разів (р(р<<00,,001), у значних кількостях синтезують також вітаміни В001), у значних кількостях синтезують також вітаміни В33,, та Вта В55.. Встановлено, що усі досліджувані штами продукували у незначній Встановлено, що усі досліджувані штами продукували у незначній кількості оцтову та пропіонову кислоти, проте тільки штам кількості оцтову та пропіонову кислоти, проте тільки штам E. durans E. durans SB18 був SB18 був здатний до синтезу молочної кислоти, зокрема, здатний до синтезу молочної кислоти, зокрема, їїїї ккоонцентрація вірогідно нцентрація вірогідно підвищувалась у 2,6 рази ( рпідвищувалась у 2,6 рази ( р<<0,01) порівняно до контролю. 0,01) порівняно до контролю. ТоксикоТоксико--біологічними дослідженнями встановлено, що досліджувані біологічними дослідженнями встановлено, що досліджувані штами ентерококів не патогенні, не інфекційні,штами ентерококів не патогенні, не інфекційні, не володіють каталазною не володіють каталазною активністю, не продукують лецитиназактивністю, не продукують лецитиназу,у, ппллазмокоагулазу та фібринолізин, що азмокоагулазу та фібринолізин, що дає змогу віднести ці мікроорганізми до нешкідливих для макроорганізму.дає змогу віднести ці мікроорганізми до нешкідливих для макроорганізму. 4 Досліджувані штами проявляли високі технологічні властивості, зокрема, Досліджувані штами проявляли високі технологічні властивості, зокрема, штами штами E. durans E. durans SB20 та SB18 проявили найкращі кислотоуворювальні SB20 та SB18 проявили найкращі кислотоуворювальні властиввластивососттіі,, оскільки були здатними знижувати рН середовища при їх оскільки були здатними знижувати рН середовища при їх культивуванні як на 24 год, так і на 48 год за різних температурних режимів, при культивуванні як на 24 год, так і на 48 год за різних температурних режимів, при цьому значення рН сягало 5 одиниць і менше. Крім того, досліджувані цьому значення рН сягало 5 одиниць і менше. Крім того, досліджувані ентерококи поентерококи по--різному накопичували біомасу, прирізному накопичували біомасу, при ццььоомму відзначено як у відзначено як міжвидову, так і міжштамову різницю. Найвищу інтенсивність росту за міжвидову, так і міжштамову різницю. Найвищу інтенсивність росту за температури культивування 37температури культивування 37ооС спостерігали при культивуванні штамів С спостерігали при культивуванні штамів E. duransE. durans SB18 таSB18 та SB6. Штами ентерококів проявили високу солестійкість.SB6. Штами ентерококів проявили високу солестійкість. Ентерококи добре переносЕнтерококи добре переносилилии ннесприятливі умови травного тракту, есприятливі умови травного тракту, зокрема, виживали та розмножувались в умовах різних значень рН середовища зокрема, виживали та розмножувались в умовах різних значень рН середовища та жовчі. Встановлено, що із досліджуваних чотирьох штамів ентерококів при та жовчі. Встановлено, що із досліджуваних чотирьох штамів ентерококів при показнику рН 4 два штами показнику рН 4 два штами E. durans E. durans SB18 та SB18 та E. durans E. durans SB20 виживали SB20 виживали тата ппрроявляли добрі ростові властивості. При культивуванні штамів оявляли добрі ростові властивості. При культивуванні штамів E.E. durans durans SB18 SB18 та та E. durans E. durans SB20 за значення рН 5 оптична густина середовища була вищою, SB20 за значення рН 5 оптична густина середовища була вищою, відповідно, у 9,8 та 10,8 рази (відповідно, у 9,8 та 10,8 рази (рр<<0,001)0,001). Ці самі штами проявили найкращі . Ці самі штами проявили найкращі ростові властивості і за рН ростові властивості і за рН 6 6 ттаа 7 одиниць. За культивування досліджуваних 7 одиниць. За культивування досліджуваних штамів ентерококів у середовищі із 20 та 40% жовчі та високих концентрацій штамів ентерококів у середовищі із 20 та 40% жовчі та високих концентрацій Натрію хлориду (від 3 до 6,5%), вони упродовж 21 доби зберігали свою Натрію хлориду (від 3 до 6,5%), вони упродовж 21 доби зберігали свою життєздатність.життєздатність. Для створення заквашувального препатату з метою Для створення заквашувального препатату з метою нанаддаанння готовому ня готовому продукту функціональних властивостейпродукту функціональних властивостей було використано було використано перспективні для перспективні для промисловості культурипромисловості культури молочнокислих бактерій молочнокислих бактерій L. lactisL. lactis IMAU 32258IMAU 32258, , Lb. plantarum Lb. plantarum KLDS 1.0728 таKLDS 1.0728 та E.E. durans durans SB18SB18,, виділені з традиційної виділені з традиційної карпатської бринзи і які характкарпатської бринзи і які характерерииззуувалися високими антагоністичними та валися високими антагоністичними та технологічними властивостями. На основі цих штамів розробили птехнологічними властивостями. На основі цих штамів розробили п’’ять ять композицій композицій МКБМКБ у різних співвідношеннях у різних співвідношеннях L. lactis, Lb. plantarum L. lactis, Lb. plantarum і і E. durans:E. durans: № 1 (50:25:25), № 2 (33:33:33), № 3 (50:40:10), № 4 (50:10:40), № 5 (7№ 1 (50:25:25), № 2 (33:33:33), № 3 (50:40:10), № 4 (50:10:40), № 5 (70:0:1155::15. 15. При цьому встановили, що досліджувані штами При цьому встановили, що досліджувані штами МКБМКБ не проявили міжвидового не проявили міжвидового 5 антагонізму. Підтвердженням сумісності культивування антагонізму. Підтвердженням сумісності культивування МКБМКБ була інтенсивність була інтенсивність накопичення біомаси, активність кислотоутворення та антагоністична накопичення біомаси, активність кислотоутворення та антагоністична активність до патогенної та умовактивність до патогенної та умовноно--ппаатогенної мікрофлори.тогенної мікрофлори. Так, за Так, за температури 37температури 37ооC вища інтенсивність росту встановлена при культивуванні C вища інтенсивність росту встановлена при культивуванні композицій № 1, № 2 та № 3, зокрема, оптична густина зростала, відповідно, у композицій № 1, № 2 та № 3, зокрема, оптична густина зростала, відповідно, у 17,9, 17,8 та 18,1 (17,9, 17,8 та 18,1 (рр<<0,0010,001) рази порівняно до контролю. Однак, найкращі ) рази порівняно до контролю. Однак, найкращі кикиссллоотоутворювальні властивості проявили композиції № 1, № 3 та № 5 за тоутворювальні властивості проявили композиції № 1, № 3 та № 5 за температури 32температури 32ооС. За спільного культивування різних композицій С. За спільного культивування різних композицій МКБМКБ за за температури 32 та 37температури 32 та 37ооС було встановлено, що всі композиції володіли помірною С було встановлено, що всі композиції володіли помірною активністю щодо активністю щодо умовноумовно--патогенних мікрпатогенних мікрооооррггаанізмів. Необхідно відзначити, нізмів. Необхідно відзначити, що найвищу антагоністичну активність проявила композиція що найвищу антагоністичну активність проявила композиція МКБМКБ № 3.№ 3. Для Для подальших досліджень вибрано композицію № 3 подальших досліджень вибрано композицію № 3 –– L. lactis: Lb. plantarumL. lactis: Lb. plantarum:: E. E. durans durans SB18 у співвідношенні 50:40:10SB18 у співвідношенні 50:40:10.. При визначенні пробіотичних властивоПри визначенні пробіотичних властивостстеейй сформованої композиції МКБ сформованої композиції МКБ встановили позитивний вплив на кровотворну функцію організму лабораторних встановили позитивний вплив на кровотворну функцію організму лабораторних тварин (білих щурів). Так, за 14 добового застосування тварин (білих щурів). Так, за 14 добового застосування композиції вірогідно композиції вірогідно зросла концентрація гемоглобіну, кількість еритроцитів, лейкоцитів та велизросла концентрація гемоглобіну, кількість еритроцитів, лейкоцитів та величичиннаа гематокриту, відповідно, на 14,9, 14,7, 22,5 (ргематокриту, відповідно, на 14,9, 14,7, 22,5 (р<<0,05) та 5,7 %. 0,05) та 5,7 %. Застосування Застосування композиції композиції МКБМКБ стимулювало збільшення лактостимулювало збільшення лакто-- та біфідобактерій вмістимого та біфідобактерій вмістимого товстого відділу кишечника білих щурів і сприяло вірогідному зменшенню товстого відділу кишечника білих щурів і сприяло вірогідному зменшенню чисельності умовночисельності умовно--патогенноїпатогенної ттаа ггнильної мікрофлори.нильної мікрофлори. Застосування композиції Застосування композиції МКБМКБ упродовж усього періоду експерименту упродовж усього періоду експерименту викликало інгібуючий вплив на інтенсивність процесів ПОЛ, що у свою чергу, викликало інгібуючий вплив на інтенсивність процесів ПОЛ, що у свою чергу, призвело до зниження вмісту ТБКпризвело до зниження вмісту ТБК--активних продуктів та гідропероксидів активних продуктів та гідропероксидів ліпідів. Зокрема, наліпідів. Зокрема, на 1144--тту добу застосування консорціуму МКБ вмісту добу застосування консорціуму МКБ вміст ТБКТБК--активних продуктів та гідропероксидів ліпідів знизився, відповідно, на 6,1 активних продуктів та гідропероксидів ліпідів знизився, відповідно, на 6,1 та 4,1%, а на 21та 4,1%, а на 21--шу добу шу добу –– на 14,9 та 22,1% (рна 14,9 та 22,1% (р<<0,01). Застосування композиції 0,01). Застосування композиції МКБ спричинило зростання ЛАСК та зниження рівня ЦІК.МКБ спричинило зростання ЛАСК та зниження рівня ЦІК. ППоорряяд з цим, на 21д з цим, на 21--шу добу експерименту встановлено тенденцію до зниження вмісту загальних шу добу експерименту встановлено тенденцію до зниження вмісту загальних 6 ліпідів у тканині печінки щурів дослідної групи. Також у печінці щурів ліпідів у тканині печінки щурів дослідної групи. Також у печінці щурів дослідної групи виявили менший вміст неестерифікованого холестеролу та дослідної групи виявили менший вміст неестерифікованого холестеролу та більший більший –– фосфоліпідівфосфоліпідів. . УУ ттварин дослідної групи вірогідно меншим було варин дослідної групи вірогідно меншим було співвідношення між неестерифікованим холестеролом і фосфоліпідами. співвідношення між неестерифікованим холестеролом і фосфоліпідами. ТТенденція до зниження рівня неестерифікованих жирних кислот і енденція до зниження рівня неестерифікованих жирних кислот і триацилгліцеролів вказує на позитивний вплив композиції МКБ на обмін ліпідів триацилгліцеролів вказує на позитивний вплив композиції МКБ на обмін ліпідів уу ппееччіінці.нці. Враховуючи високі пробіотичні та технологічні характеристики Враховуючи високі пробіотичні та технологічні характеристики композиції МКБ, на її основі розроблено заквашувальний пробіотичний композиції МКБ, на її основі розроблено заквашувальний пробіотичний препарат, який отримав назву препарат, який отримав назву «Ентероплан»«Ентероплан». У склад препарату входять такі . У склад препарату входять такі штами МКБ:штами МКБ: L. lactis ssp. lactis IMAU L. lactis ssp. lactis IMAU 3223225858,, LLb. plantarum KLDS b. plantarum KLDS 1.07281.0728 тата E. durans E. durans SB18 уSB18 у співвідношенні 50:40:10.співвідношенні 50:40:10. Бринза, виготовлена з використанням заквашувального препарату Бринза, виготовлена з використанням заквашувального препарату «Ентероплан»«Ентероплан» ((L. lactis, Lb. plantarum, E. duransL. lactis, Lb. plantarum, E. durans), порівняно із бринзою, ), порівняно із бринзою, виготовленою із препаратом RSF (Chr. Hansen)виготовленою із препаратом RSF (Chr. Hansen), , ммааєє вираженіший, більш вираженіший, більш насичений, вершковий смак та аромат і кращу консистенцію, що пов’язано із насичений, вершковий смак та аромат і кращу консистенцію, що пов’язано із залученням виділених із традиційної карпатської бринзи мікроорганізмівзалученням виділених із традиційної карпатської бринзи мікроорганізмів, , які в які в процесі своєї життєдіяльності сформували кращі органолептичні процесі своєї життєдіяльності сформували кращі органолептичні характеристики сихарактеристики сируру.. ЗЗа результатами балової оцінки бринзи за смаком, запахом а результатами балової оцінки бринзи за смаком, запахом та консистенцією дослідний зразок отримав 87 балів, а контрольний та консистенцією дослідний зразок отримав 87 балів, а контрольний –– 84. Під 84. Під час процесу визрівання чисельність молочнокислої мікрофлори у дослідному час процесу визрівання чисельність молочнокислої мікрофлори у дослідному зразку бринзи, виготовленому із заквашувальнимзразку бринзи, виготовленому із заквашувальним ппррееппаратом аратом «Ентероплан», «Ентероплан», була у 1,5була у 1,5--2 рази вищою порівняно з контрольним зразком. З огляду на це, 2 рази вищою порівняно з контрольним зразком. З огляду на це, заквашувальний препарат «Ентероплан» можна використовувати у технології заквашувальний препарат «Ентероплан» можна використовувати у технології бринзи у промислових умовах.бринзи у промислових умовах. На основі одержаних результатів розроблено технічні умоНа основі одержаних результатів розроблено технічні умовиви УУккраїни раїни ТУТУ У 10.5У 10.5––0049299000492990––028:2021028:2021 затверджено ТК 132 Держспоживстандарту затверджено ТК 132 Держспоживстандарту України «Засоби захисту тварин, корми і кормові добавки»України «Засоби захисту тварин, корми і кормові добавки». . Наукову новизну досліджень підтверджено патентом України на корисну Наукову новизну досліджень підтверджено патентом України на корисну 7 модель модель ««Спосіб визначення штамів ентерококів для сСпосіб визначення штамів ентерококів для ствтвоорреення пробіотичної ння пробіотичної закваски», закваски», №№ uu 202101868; заявл. 09.04.2021; опубл.13.10.2021. Бюл. № 41.202101868; заявл. 09.04.2021; опубл.13.10.2021. Бюл. № 41. КлючовіКлючові словаслова:: молочнокислімолочнокислі бактерії,бактерії, ентерококи,ентерококи, молоко,молоко, антибіотикорезинстентність,антибіотикорезинстентність, пробіотики,пробіотики, бактеріальнібактеріальні препарати,препарати, біологічнабіологічна дія,дія, сир,сир, органолептична оцінкорганолептична оцінкаа.